摘要
细胞膜衍生微粒(MPS)作为细胞间通讯的重要介质，在天然药物释放系统中得到了广泛的应用。在此，我们检测了肿瘤细胞来源的MPS(TMPS)在恶性胸腔积液(MPE)中的治疗潜力。TMPS包装化疗药物甲氨蝶呤(TMPS-MTX)能明显抑制小鼠Lewis肺癌和结肠腺癌细胞诱导的MPE生长，并有利于MPE的存活。基于TMPS-MTX的潜在益处和最小毒性，我们进行了一次自体TMPS包装甲氨蝶呤(ATMPs-MTX)胸膜腔内给药的人体研究，以评估其安全性、免疫原性和临床活性。我们报告了11例晚期肺癌患者MPE的研究结果。我们发现制造和注射ATMPs-MTX是可行和安全的，没有3级或更高级别的毒性影响的证据。对MPE肿瘤微环境的评价显示，注射ATMP-MTX后，MPE中的肿瘤细胞和CD巨噬细胞显著减少，并转化为客观的临床反应。此外，ATMPMTX刺激CD4T细胞释放IL-2，CD8T细胞释放干扰素-γ。ATMPs-MTX治疗晚期肺癌合并MPE的初步经验表明，针对恶性细胞和免疫抑制微环境的ATMPs有望成为治疗恶性肿瘤的一种有前途的治疗平台。
我们已经证明，肿瘤细胞来源的MPS(TMPS)，携带肿瘤抗原重复序列、共刺激分子和类似于它们的亲代细胞的DNA片段，可以诱导强有力的T细胞依赖性抗肿瘤免疫应答，并在黑色素瘤、肝细胞癌和结肠癌的小鼠模型中获得治疗效果。因此，TMPS的靶向性和免疫刺激作用导致了将甲氨蝶呤(MTX)掺入TMPS产生双功能MPS(TMPS-MTX)的双重免疫化学治疗方法的发展和应用。
ZhangHuafeng,TangKe,ZhangYietal.Cell-freetumormicroparticlevaccinesstimulatedendriticcellsviacGAS/STINGsignaling.[J].CancerImmunolRes,,3:-.
肺癌是世界范围内癌症相关死亡的主要原因，5年生存率根据分期和地区差异从4%到17%不等。非小细胞肺癌(NSCLC)占所有肺癌病例的85%以上(23例)，约40%的晚期NSCLC与胸膜转移有关，导致胸膜旁积液，称为恶性胸腔积液(MPE)。肺肿瘤MPE患者的生存期短于非肺原发肿瘤引起的MPE患者。目前的姑息性治疗，包括胸膜固定术和留置胸腔导管来管理MPE在疗效和安全性方面都不是最理想的，并且迫切需要寻找病因治疗方法。因此，晚期肺癌继发的难治性MPE(目前尚无针对肿瘤促进机制的有效治疗方法)为研究化学免疫治疗方法提供了一个很有吸引力的临床环境。选择MPE中的自体恶性细胞作为供体细胞用于制备负载化疗药物MTX(ATMPs-MTX)的自体TMPS，以解决与免疫相容性和肿瘤异质性有关的问题。
本文用TMPS给药，研究了TMPsMTX对免疫活性强的小鼠肺癌(LLC)、结肠腺癌(MC38)诱导的MPE和原发性肺癌MPE患者的靶向细胞毒作用，结果表明：TMPsMTX对小鼠免疫功能低下的肺癌(LLC)、结肠腺癌(MC38)诱导的MPE有明显的靶向杀伤作用。
TMPS和TMPS-MTX的表征
Fig.1
本研究选择小鼠LLC(肺)、小鼠MC38(结肠)、小鼠B16-F10(皮肤)、人A(肺)、人MCF-7(乳腺)和其他癌细胞作为TMP产生的供体细胞。将甲氨蝶呤(MTX)与肿瘤细胞在紫外线(UVBJm-?-2)照射下于室温下孵育至TMPS中。根据形态、大小和蛋白质含量对TMPS进行了表征(图1,A至D)。透射电子显微镜(TEM)显示TMPS呈不规则的球形或杯状形态(1A)。纳米粒子追踪分析表明，作为对照的单纯空白TMPS的直径为10~nm，平均直径为nm，峰(模)直径为~93nm，而TMPS-MTX的直径为30~nm，平均直径为nm，峰(模)直径为nm(1B)
流式细胞仪分析显示，A细胞膜上存在一种常用的MP标记物AnnexinV和两种细胞表面蛋白：上皮细胞粘附分子(EpCAM)和CD(1C)。其他细胞外囊泡相关蛋白，如CD9，CD63和肿瘤易感基因蛋白(TSG)，也进行了检测(1D)。此外，用高效液相色谱(HPLC)分析得到的小鼠肝细胞来源的TMPS-MTX中甲氨蝶呤的载药量为1ug，并随供体细胞培养液中初始药物浓度的增加而逐渐增加(1E)。
高效液相色谱分析结果表明，在冷藏72h后，游离甲氨蝶呤和负载甲氨喋呤在紫外线照射下均未发生明显降解，说明在此期间，甲氨蝶呤的性能不会受到紫外线照射引起的甲氨蝶呤降解的影响(图F和G)。有研究表明TMPS具有促进癌症的潜力。因此，我们还探讨了TMPS在体外和MPE模型中的促肿瘤作用。结果表明，紫外线诱导的TMPS在体外和体内均无促肿瘤作用，而天然分泌的TMPS在体外可增强肿瘤细胞的存活率和侵袭力，在体内可促进MPE的进展(图F到I)，说明诱导策略可能影响TMP的效价和异质性。因此，在随后的MPE模型中，UVB诱导的MPS被用于治疗背景下的MPE。
Fig.2
TMP-MTX的体外吸收效率及细胞毒作用
其次，我们用量子点(QD)标记的TMPS在A细胞中研究了TMPS将药物有效载荷传递到靶细胞中的能力。共聚焦图像显示TMPS在A细胞中堆积(图A和B)。用PKH26标记的TMPS-MTX对同一细胞分别孵育1，6，12，24h后进行流式细胞仪分析。结果显示，A细胞对TMPS-MTX的摄取呈时间依赖性(图2C)。在24小时的时间点，大约87%的A细胞中有TMPS-MTX的存在。TMP-MTX摄取的特定时间曲线表明，在随后的细胞毒性测试中，至少应选择靶细胞培养24小时。
为了验证这些TMPS-MTX是否对肿瘤细胞具有细胞毒性，我们将含有MTX浓度梯度的TMPS-MTX加入到以游离MTX为对照的肿瘤细胞培养液中。用流式细胞仪检测LLC细胞在不同时间点的凋亡情况。用甲氨蝶呤(ug/ml)包被甲氨喋呤(总剂量为1ug/ml)，48h后，细胞凋亡率明显高于游离甲氨蝶呤(10ug/ml)，其中10mmol/ml甲氨喋呤与2×10^6TMPS甲氨喋呤共孵育48h后，细胞凋亡率明显高于游离甲氨喋呤。而川芎嗪-甲氨蝶呤组与游离甲氨蝶呤(ug/ml)组之间无显著性差异，这可能与其对甲氨喋呤的高敏感性有关。其次，对3例原发性肺腺癌患者的恶性细胞进行了TMPs-MTX的细胞毒作用试验，结果表明：总剂量为2ug的包装MTX诱导的死亡率高于ug的游离MTX(图2D)，说明TMPs-MTX具有较高的细胞毒作用(P0.05)，且与对照组相比无显著性差异(P0.05)2E。其他肿瘤细胞也有类似的细胞毒作用，包括A(肺)、MCF-7(乳腺)和B16-F10(皮肤)(图2F)。进一步探讨了TMPS-MTX与包括巨噬细胞和T细胞在内的免疫细胞的相互作用。结果表明，TMPS-MTX能有效地被RAW.7细胞摄取，从而诱导细胞凋亡。但只有一小部分TMPS-MTX能被从健康献血员外周血分离出来的T细胞摄取(图S3D)。总之，这些数据表明MTX包装的MPS在体外对肿瘤细胞和巨噬细胞有直接的细胞毒作用，但对T细胞没有直接的细胞毒作用。
荧光TMPs在体内的靶向和内化
Fig.3
用近红外荧光染料Dir标记TMPS，研究了TMPS在健康小鼠体内的生物分布。静脉注射TMPS组DiR荧光主要分布在腹腔(肝、脾)，胸膜注射组主要分布在胸部和腹部(肺、肝、脾)，用活体荧光显像进一步证实了DIR荧光主要分布在腹腔(肝、脾、肺)(A至C)。
其次，利用荧光素酶稳定转染的LLC-Luc细胞在C57BL/6小鼠体内建立MPE模型，探讨TMPS在小鼠体内的生物分布。分别于术后1、3、24、48h行体内显像，检测TMPS在胸膜内的动态分布。如图3A所示,胸膜腔内给药后24小时内胸膜TMPS的蓄积迅速增加(P0.05或P0.05)。此后，TMPS的荧光信号开始减弱，但在48h时仍维持在较高水平，表明TMPS能在胸膜腔内有效蓄积并停留相当长的时间。在24小时的时间点，小鼠被安乐死，并切除器官进行荧光成像(图1)。3、B和C)。静脉注射组TMPS主要积聚于肝脏和脾脏，其次为肺部。然而，在肿瘤组织中观察到了大量的TMP积累，表明静脉注射的MPS可以传递到肿瘤。br/与全身给药相比，胸腔内注射导致TMPS在肺部的沉积最大，其次是肿瘤。这些结果表明，局部胸腔内给药可能是首选途径，因为与MPE模型中全身给药相比，局部胸腔内给药能使TMPS在胸膜腔内的肿瘤组织中更多地积聚。
我们还探讨了PKH67标记的TMPS在MPE小鼠体内的特异性细胞内化。对MPE细胞颗粒和胸膜肿瘤冰冻切片的原位观察显示，PKH67荧光信号阳性细胞主要位于CD11b和F4/80阳性细胞中，而CD3阳性细胞(T淋巴细胞标志)仅少数阳性细胞中有少量PKH67荧光信号阳性，而CD11b和F4/80阳性细胞中仅有少量阳性细胞(T淋巴细胞标记物)阳性，PKH67荧光信号主要分布在CD11b和F4/80阳性细胞中。(图DE)流式细胞仪分析显示，PKH67标记的TMPS主要被CD11b+细胞[包括肿瘤相关巨噬细胞(TAMs)和多形核粒细胞(PMNs)]和胸腔积液及原发肿瘤细胞所摄取，而只有少数TMPS被CD3+T细胞摄取(图1)，而CD11b+细胞(包括肿瘤相关巨噬细胞(TAMs)和多形核白细胞(PMNs)和肿瘤细胞均可摄取PKH67标记的TMPS(图3F)。
4.TMPS-MTX胸腔内给药对小鼠MPE模型的抗肿瘤作用
为探讨TMPSMTX对小鼠胸腔积液的潜在影响，我们用LLC、LLC-LUC或MC38细胞分别接种C57BL/6小鼠，然后以4×10~6颗粒/50ul的剂量进行胸腔内对照或TMP-MTX治疗。14天后(或MC38细胞注射后12天)对小鼠进行评估。主要终点为胸膜肿瘤负荷和胸腔积液。除了计数胸膜病灶外，我们还利用生物发光成像技术检测LLC细胞中荧光素酶的活性，以评估胸膜肿瘤的负担。与PBS组、空TMP0组和游离MTX组相比，TMPMTX组胸膜肿瘤负荷、胸膜病灶数目和胸腔积液体积均明显减少(A至E)。为了确定TMPS-MTX是否适用于其他肿瘤，我们使用了另一种小鼠结肠腺癌模型(MC38)。与LLC模型相似，TMPMTX对MC38细胞诱导的胸膜肿瘤灶和mPE体积均有明显的抑制作用(F和G)。
为了更好地了解TMPS-MTX抑制MPE形成的机制，我们测定了四组胸膜肿瘤细胞的微血管密度和凋亡，取分布于内脏和顶叶胸膜表面的胸膜肿瘤用福尔马林固定，石蜡包埋切片用抗CD31抗体染色检测微血管密度，TUNEL法检测凋亡指数。结果表明，经TMPS-MTX处理的小鼠，CD31的表达明显降低，而TMP-MTX组凋亡癌细胞密度高于3个对照组，而TMP-MTX组凋亡细胞密度明显高于3个对照组(4I)。寿命分析显示，PBS-、空TMP0-、TMP-MTX-和游离MTX处理的LLC细胞诱导的MPE小鼠的中位生存期分别为17、21、24和19d，而空白TMP0、TMP-MTX和自由MTX处理的小鼠的中位存活时间分别为17、21、24和19天(图4J)。MC38模型的中位生存期也有类似的改善(图4K)。总之，这些结果表明TMPsMTX对两种不同的小鼠腺癌诱导的MPE有效。
5.TMPS-MTX在小鼠MPE模型抑制肿瘤微环境的转移
我们首先分析了MPE在MC38细胞诱导的MPE小鼠体内的细胞构成。经川芎嗪-甲氨蝶呤处理后，CD45?细胞比例降低，提示肿瘤细胞浸润减少(图5A)。TMP-MTX组CD3+~CD3+CD4+和CD3+CD8+T细胞同时升高。CD4/CD8比值和Foxp3+T细胞频率的变化无统计学意义(图5B)。进一步分析髓系细胞(CD45+CD3、CD11b+)的变化，发现川芎嗪-甲氨蝶呤组PMN增多(图5C)，这可能是甲氨蝶呤细胞毒性引起的炎症反应和TAMs显著减少(P=0.)(图5D)，证实TMPS-MTX对TAMs的选择性细胞毒作用。总的来说，MPE中T细胞(包括CD3+、CD3+CD4+和CD3+CD8+T细胞)的增加和TAMs的减少表明TMP-MTX对微环境免疫抑制有抵抗作用。
考虑到胸膜实体瘤组织由于生理屏障和相对有限的穿透肿瘤组织可能具有不同于胸腔积液的TMPS-MTX分布，我们下一步寻求确定胸膜肿瘤中的免疫浸润。TMP-MTX治疗组的CD45+浸润比例高于其他组，提示TMP-MTX治疗组的炎症表型更明显(图5E)。胸膜肿瘤中肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)中CD4+和CD8+T细胞的比例明显增高,CD4+和CD8+T细胞在肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)中所占的比例明显增加(图5F)。与CD4+T细胞相比，CD8+T细胞明显增加，导致CD4/CD8比值下降(图5G)。同时，经TMP-MTX治疗后，PMN频率增加，TAMs比例下降，与MPE相似(图5I和J)。胸膜肿瘤免疫细胞的整体改变与抗肿瘤免疫微环境一致。
在T细胞方面，川芎嗪-甲氨蝶呤处理组与对照组相比，T细胞频率虽无明显变化，但CD3+和CD3+CD8+T细胞与游离甲氨蝶呤处理组相比有显著性差异，但与对照组相比差异无统计学意义，而CD_3~+T细胞和CD_3~+CD_8~+T细胞比例差异无统计学意义。此外，胸膜肿瘤的CD_4/CD_8比值明显降低。我们还调查了血液中相应的免疫细胞。在LLC和MC38模型中，经TMP-MTX治疗后，PMN和巨噬细胞均增加(图A和B)。因此，TMPMTX除了减少肿瘤浸润的?细胞和TAMs外，还增加了免疫效应细胞的比例，促进了抑瘤性免疫微环境的形成。
Fig.6
胸膜内注射ATMPs-MTX
对晚期肺癌和MPE的抗肿瘤作用
我们启动了一项人体临床试验，以评估ATMPs-MTX胸腔内灌注治疗晚期肺癌和MPE的安全性和可行性。年1月至年12月，12例经组织细胞学证实为MPE的肺癌患者(女性4例，男性8例)参与了这项试验。除1例患者未接受ATMPsMTX治疗后病情迅速恶化外，其余患者均完成了全部治疗，因此退出研究。这位病人的数据被排除在分析之外。其余病人的特征见表S1。符合条件的患者通过胸膜腔内注射MTX治疗，每隔一天6次(图1)。S7A)。根据动物研究，ATMPS-MTX的初始剂量为5U，总剂量为20ug，比一线化疗中免费使用的MTX剂量(至少10mg/m2)低几个数量级。观察ATMPs-MTX对MPE的体内影响，在基线和每次输注后常规检查胸腔积液，在基线、治疗结束时(治疗第12天)和28天随访时通过超声和CT扫描来监测ATMPs-MTX对MPE的影响。取全血观察ATMP-MTX输注相关不良反应及免疫相关变化(图6A)。根据美国国家癌症研究所(CTCAEv3)的通用毒性标准第3版，对11名参与者的数据进行了不良事件评估。在所有患者的治疗过程中，共记录了6种不良事件(表S2)。ATMP-MTX注射液无急性毒性反应。与使用ATMPs-MTX有关的最常报告的不良事件是轻微的(1~2级)，包括头晕、发热、恶心和呕吐。未发现肝、肾、肺、心脏、血液学或神经毒性。未观察到自身免疫反应的临床表现。
临床疗效表现为胸腔积液量减少，临床疗效符合英国胸科学会胸膜疾病指南，11例MPE患者中有10例症状改善(27例)。例如，对一例56岁女性肺癌伴难治性MPE患者的CT图像和胸腔积液体积的测量清楚地证实了ATMP-MTX治疗对MPE的控制(图6B)。11例患者中，完全缓解(CR)4例，部分缓解(CR)6例，无效1例。客观有效率为90.91%(10/11)。胸膜固定术的中位时间为7天(图1)。6C)。通过28天的评估，4例达到CR的患者胸膜固定术的中位时间仅为5天。长期的胸腔积液控制评估显示，11例患者中有9例(81.81%)在死亡前不需要进一步的胸腔引流治疗。在其余两名患者中，一名患者接受了一次治疗性引流，另一例未能完成胸膜固定术。除了MPE的量外，包括液体颜色在内的MPE的特性也受到ATMPS-MTX的影响，如图所示。S7B。虽然目前还没有关于红细胞数量与治疗反应之间关系的普遍肯定的结论，但红细胞的减少可能表明MPE(31)中血管通透性的改善。
为了评价ATMP-MTX对肿瘤细胞的实际杀伤作用，我们对8例患者应用ATMP-MTX前后的胸水细胞学进行了检测。临床活动与胸腔积液中肿瘤细胞减少的光学显微镜检查相关(图6D)。流式细胞仪分析显示，治疗后胸腔积液中CD45mRNA细胞明显减少，提示治疗后胸腔积液中肿瘤细胞明显减少，细胞数量明显减少，肿瘤细胞明显减少(6E)。经ATMP-MTX治疗后，MPE和血液中癌胚抗原浓度也降低，表明ATMP-MTX对肿瘤细胞具有细胞毒作用，是晚期NSCLC患者化疗疗效的可靠替代指标(32例)S7D.
在这项研究中，总的中位生存期为天(95%的置信区间，从天到无限大)(表S1)。由于参与研究的患者数量很少，因此我们无法从我们的研究中得出关于ATMP-MTX治疗效果的确切结论。
ATMPs-MTX对MPE患者
胸膜微环境免疫功能的影响
Fig.7
进一步证实了ATMPs-MTX对胸膜免疫浸润的调节作用。流式细胞仪检测MPE中T细胞(包括CD3+CD4+T细胞、CD3+CD8+T细胞和Tregs)的比例。图7A，尽管第二次输注ATMPS-MTX后明显增加，但总淋巴细胞浸润与基线相比没有变化。经ATMP-MTX治疗后，MPE中CD4+T细胞略有增加，CD8+T细胞无明显变化。进一步分析研究对象中mPE的TIL，发现治疗后分泌干扰素-?的T细胞比例增加(图7B)。ATMPS-MTX可使CD_4~+细胞产生IL-2的量增加2.5倍，CD_8~+细胞产生的增加~2倍(图7C和D)。这些结果表明，ATMPs-MTX可激活细胞毒性T淋巴细胞(CTL)/辅助性T细胞1(TH1)应答，诱导机体产生抗肿瘤免疫。
我们进一步剖析了髓系细胞群的变化。骨髓细胞数量在第一次灌注后第3天达到高峰，然后下降，这表明ATMPs-MTX对肿瘤细胞具有细胞毒性作用，这是一种典型的急性炎症反应(图7F),人“抑制性”粒细胞(CD45+CD11b+CD15+-CD66b+)，又称TANS，在3例患者的MPE标本中检测到(图7G)，在注射ATMP-MTX期间下降。MPE中单核细胞及其TAM亚型(CD45+CD14+CD+)持续清除，证实ATMP-MTX治疗引起的小鼠单核/巨噬细胞变化与晚期肺癌所致MPE患者相似(图7H和I)。
在ATMP-MTX治疗过程中和治疗后的不同时间点采血，观察其免疫状况(图S8A)。ATMP-MTX治疗与循环髓系细胞(包括循环中性粒细胞和单核细胞)的绝对数量增加有关，这些细胞在治疗第12天达到峰值，但仍在正常范围内，并伴随着淋巴细胞绝对数量的短暂减少。循环髓系细胞的这种改变可被认为是局部胸膜腔炎和随后消耗上述TANS和TAMs的副作用(图7F至I)。T细胞中CD4+、CD8+和IFN+T细胞的相对频率不受ATMPS-MTX细胞毒作用的影响(图S8A)。
除免疫细胞浸润的变化外，MPE患者经ATMP-MTX治疗后胸膜腔内也观察到细胞因子/趋化因子的改变(图7J)。治疗后肿瘤坏死因子和干扰素以及TH17细胞产生的关键细胞因子IL-17的生成量均明显增加。MCP-1/C-C基序趋化因子2(MCP-1/C-CMotifchemokine2，MCP-1/C-C基序)浓度与液体容量相关，可能是MPE治疗的关键靶点。在接受ATMPs-MTX治疗的8例患者中，有6例患者的MPE中MCP-1浓度降低。而TH2细胞的关键细胞因子IL-4和其他重要细胞因子如血管内皮生长因子、IL-6和IL-10的浓度则无明显变化(图S8B)。总之，这些数据表明，除了对巨噬细胞耗竭的影响，ATMP-MTX治疗可以增加肿瘤微环境中与趋化因子分泌相关的抗肿瘤效应细胞(包括CTL和TH1细胞)的激活。
原文参考：GuoMengfei,WuFeng,HuGuorongetal.Autologoustumorcell-derivedmicroparticle-basedtargetedchemotherapyinlungcancerpatientswithmalignantpleuraleffusion.[J].SciTranslMed,,11.
长按