技术中科基因采样标准流程及注意事项

01病原检测采样的原则及要点1、当前病原体检测的主要方法:1.1病毒性病原:PCR、RT-PCR、qPCR、qRT-PCR、LAMP、NASBA1.2细菌性病原:接种分离培养、PCR1.3寄生虫病原:镜检、PCR2、检测项目的选择:检测项目应根据猪场当地疫病流行情况、临床表现和病理剖检的初步诊断来确定。2.1全身性疫病:猪瘟、蓝耳、圆环、伪狂、细菌、弓形体、附红体等2.2呼吸系统病:蓝耳、流感、伪狂犬、支原体、细菌等2.3消化系统病:流行性腹泻、传染性胃肠炎、轮状病毒、黄白痢、增生性回肠炎、副伤寒、寄生虫等。2.4繁殖障碍病:猪瘟、蓝耳、伪狂、乙脑、细小、衣原体等。3、采样一般原则3.1先排除、后取样:背景信息、非传染病因素、可能的病因;3.2尽“早”采样:   

取样时间要求在病猪死后即行采取,最好不超过2小时。剖开腹腔后,首先取材料,再作检查。

5.2注意事项:

肠道样品需在肠管两端进行打结,且需单独保存;

关节样品、皮肤、肌肉等样品,可送检整个组织或部分机体;

细菌类样品,尽量抗生物治疗前取样,避免冷冻,应保持冷藏温度(2-8℃)尽快送检。

6、采样部位:

不同病原均有不同的主要侵害器管和喜好的繁殖组织,不同病程也有其不同的主害部位,采集检测病料应选择病原含量较高的器管或组织,减少漏检率。

7、采样准备:

动物剖检工具:手术刀(刀片、刀柄)、手术锯、骨剪;

样品采集工具:注射器、载玻片、无菌棉拭子、手术剪、止血钳、无齿镊;

样品收集工具:离心管、(注射器)、标本袋(自封袋)、病理固定袋;

防护工具:手套、口罩、帽子、防护服;

其他:冰袋、冷藏箱、记号笔、铅笔等。

8、拭子样品的采集

8.1猪鼻拭子样品采集:

用于病原分离及分子生物学检测

保定猪只,右手持棉签,先将猪鼻孔周围擦干净,再使用新棉签与猪鼻中隔呈45°角轻轻插入,与鼻中隔平行方向插入约2cm,轻轻转动棉签1周,停2-3s,再轻轻转动棉签1周,拔出棉签,置于加有1ml生理盐水或PBS的无菌离心管中,冷藏保存运送。

9、积液、皮肤样品的采集9.1积液的采集:包括胸腔积液、心包积液、脑积液、关节液等;9.2采集方法:使用一次性注射器无菌抽取1-2ml;直接涂抹于载玻片上干燥后常温运送置于离心管中,冷藏/冷冻保存运输。水泡液、脓包:方法同积液采集;痂皮:无菌剪取此部位皮肤组织置于样品袋中;常温运送;10、血涂片的制作注射器采血后,滴出5-7ul的新鲜未凝固的血液或抗凝血(易引起红细胞皱缩和白细胞聚集)于干净载玻片的一端,左手拿住该载玻片的两端、右手拿住另一载玻片的一端,在左手的载玻片上由前向后接触血滴,使两载玻片约成45°角(决定厚薄,检测目的),轻轻移动使血滴成一条直线,由前向后推成均匀的薄片,空气中自然干燥。11、组织样品的采集——病理组织学检测样品采集11.1样品选择:处于急性发病期、新鲜组织样品;11.2取样部位:正常组织与病变组织交界处;11.3采样要求:避免造成人为的损伤(来回锯拉组织、镊子捏压取样部位);11.4取样大小:1*1*0.5cm(脑为径向切开、一半进行固定);11.5处理要求:广口固定容器,10%福尔马林溶液(4%的甲醛溶液)固定,组织与固定液比例1:10~20为宜,常温固定,固定前后均不可冷冻;如用作冰冻切片,则需将组织块放在0~4℃容器中,尽快送达实验室。12、抗凝血样品的采集在采血器内加入适量的抗凝剂(1%肝素、EDTA-K2、3.8%柠檬酸钠),采血后,反复颠倒采血器,使抗凝剂与血液充分混匀。02抗体检测采样的原则及要点1、采样前要考虑的几个方面:1.1采样目的:免疫评估、风险预警、疫病辅助诊断……;计划所采样品能否解决采样目的;1.2采样方法:科学、规范;1.3采样时机:及时、准时、规律性;1.4检测方法:检测方法对样品的要求,样品种类、量、状态等;1.5生物安全:人员防护、防止问题扩大、重要疫病排除;1.6样品信息:询问编号、免疫、用药、临床情况……;1.7其他方面:包装、运输、样品保存条件等。2、样品背景信息收集:2.1免疫程序:免疫日龄、疫苗种类、厂家、免疫方式;2.2临床用药:药物种类,厂家、使用量、用药途径;2.3发病情况:发病特点、日龄、典型临床症状、发病率、死亡率;2.4病理变化:各组织脏器的大体解剖病理变化;2.5现场观察:动物外观、大群、饮食、呼吸、环境、气味;2.6记录:笔记、档案、照片。3、采样时间:3.1免疫抗体:疫苗免疫后3-4周以上;3.2母源抗体:CSFV抗体20-50日龄,伪狂抗体35-70日龄;3.3野毒抗体:发病康复后2周以上。4、采样数量:样品采集量取决于本次检测的目的、内容、被检猪群健康状况等。5、血清样本量的计算公式:n=[1-(1-a)1/D]×[N-(D-1)/2]n-样本量大小a-置信区间D-估测阳性动物数N-动物总数。6、血清样本的数量:多数情况下,根据以往的实践和统计学经验,20-30以上的样本被认为是合理的(介于29和19份之间),在检测10-15%的流行的疾病时获得95%的可信度。

7、猪血液样品采集:

7.1前腔静脉采血:适用于各阶段的猪,采血量不限,可能损害迷走神经。

(右侧迷走神经较少)

7.2耳静脉采血:成年猪(经产母猪),采血量1-2ml,使用注射器或刀片;易形成血肿,血样易污染。

8、血清样本的制备:8.1血清:血液流出血管后不经抗凝处理,会很快凝成血块,随着血块逐渐缩紧会析出淡黄色的清亮液体,称为血清。8.2析出血清:采血完毕后,(一般3ml血液足够用于抗体检测)将注射器拉至最大刻度,室温下平放静止析出血清。或置于37℃温箱中1h后置2-8℃中1h,析出血清。不符合要求的血清:溶血、胶冻样、浑浊等。03样品的保存、包装、运输1、样品的包装

2、运输注意事项:

所采集的血液样品如需在采血器内直接送样,并套上针头帽,防止内容物泄露,之后10个左右注射器为一捆,用胶带缠绕捆绑,平放在保温箱内塞实,以最快途径送往实验室。

如果样品能在采集后24h内送抵实验室,则可放在加冰袋的(4℃左右)保温容器中运送。

在24h内不能将样品送往实验室,组织或已离心出血清的情况下,需将样品冷冻,装在保温箱内加冰袋维持低温状态运送。

如需寄送,装箱时要垫上足够缓冲材料。

甲醛固定的组织样品,需在常温条件下充分固定,不能冷冻,以防止组织形态改变。

3、样品的运输:

3.1要求:低温,快速、信息明确、提前沟通;

3.2注意事项:

3.2.2建议顺丰快递/大巴车;

3.2.3确保过程低温,保证样品的可用性;

3.2.4不宜运输死亡动物尸体;

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