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背景
猫冠状病毒(FCoV)可分为低毒性猫肠道冠状病毒(FECV)和高毒性猫传染性腹膜炎病毒(FIPV)。FECV的临床表现以轻度肠炎为特征。相比之下，FIPV在巨噬细胞/单核细胞中有效复制，并可导致FIP，这是一种高度致命的系统性肉芽肿疾病。FIPV以两种血清型存在，I型和II型。血清型I具有独特的刺突蛋白，而血清型II的刺突蛋白是猫和狗肠道冠状病毒之间的重组。I型FECVs/FIPVs在全世界占主导地位，但II型菌株似乎更适合组织培养。然而，I型菌株更有可能导致临床FIP症状。FCoV在全球健康猫中也很常见；不到10%的FCoV血清阳性猫发展成FIP病毒。
RT-PCR、巢式PCR、实时PCR技术已经可对FCoV进行检测和基因分型。
在本研究中，为了构建一种通用的FCoV变异体检测方法，我们对FCoV进行了全基因组分析，并开发了一种RT-PCR方法用于检测临床标本中的FCoV。PCR产物的直接测序和系统发育分析就可区分FCoV的I型和II型血清型。利用这种方法，我们研究了日本病猫FCoV毒株的群体遗传学。
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方法
对个FCoV株、7个犬冠状病毒(CCoV)株、4个传染性胃肠炎冠状病毒(TGEV)株、1个猪呼吸道冠状病毒(PRCV)株和1个貂冠状病毒(MiCoV)株进行基因组分析。
使用蔗糖梯度超速离心法从在fcwf-4细胞中增殖的FCoV79–菌株中纯化FCoV。
从临床标本(全血、胸膜液、腹水、心包积液和脑液)和被FCoV(79-株)感染的fcwf-4细胞提取RNA。并反转录。
为了构建检测FCoV毒株中变体的PCR方法，通过对所有全基因组测序的FCoV、密切相关的亚种、CCoV和TGEV毒株中nsp14基因的核苷酸序列进行多重比对来设计引物。PCR产物的预期大小为bp。用于PCR的反应体系：4μlcDNA组成，1UofExTaq，每种引物10pmol，0.2mM脱氧核苷三磷酸混合物和1×反应缓冲液，总体积25μl。反应混合物在95℃2min；95℃30s，48℃35s，72℃45s，40个循环，后在72℃下5分钟。使用6μlPCR样品，通过在溴化乙锭染色的1%琼脂糖凝胶上分析DNA片段。送公司测序。
从感染FCoV株79–的fcwf-4细胞中提取总RNA，并逆转录成cDNA。如前所述，使用实时PCR方法对病毒cDNA进行定量。
在-年期间，本研究使用了份标本(份腹水、45份胸腔积液、份血液、9份脑脊液和1份心包积液)，我们使用随机引物和本研究中构建的单一PCR靶向nsp14进行RT-PCR。为了区分I型FCoV和II型FCoV或CCoV基因型，对它们的PCR产物进行了直接测序和系统发育分析。
为了确定腹水、胸腔积液和血液标本之间检测率差异的显著性，使用MedCalc软件分析。
为了设计一种FCoV的基因分型方法，我们为所有FCoV毒株中发现的所有不同的nsp14部分氨基酸序列(aa)指定了一个ST编号，这些序列在本研究中进行了测序，并已在NCBI数据库中注册。我们比较了日本FCoV毒株与6个不同国家全基因组测序毒株的群体遗传结构。
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结果
为了比较I型FCoV和II型FCoV以及密切相关的亚种CCoV、TGEV和PRCV之间的基因组结构，我们进行了基于blast的全基因组比较。在进行基因分型后，根据基于与FCoV株UU9的核苷酸相似性的得分(0-),对每个病毒株中bp的基因组区域进行颜色编码。在具有FCoV-II基因型的所有毒株的基因组结构中，在从nsp12的前半部分到核衣壳基因上游延伸约12，bp的基因组中发现了大规模重组事件，重组位点在不同毒株间略有不同。在基于nsp13、nsp14、nsp15、nsp16和spike的串联序列的系统进化树中，所有FCoV-II型毒株被聚类成属于犬冠状病毒毒株的进化枝。在FCoV、CCoV、TGEV和PRCV所属的α冠状病毒1亚种中，从nsp14到nsp16的编码区是最高度保守的。
基于在NCBI使用基因分型工具进行的全基因组比较，我们将nsp14至nsp16内的蛋白质编码序列作为候选PCR靶。由于其高度保守的序列，该序列区适合于变体的普遍检测。在根据在所有FCoV、CCoV、TGEV和PRCV毒株中保守的核苷酸序列设计的引物组中，我们确定了最佳引物组nsp14-F和nsp14-R，这种PCR普遍适用于所有α-冠状病毒1亚种。
我们从腹水、胸腔积液、心包积液和血液样品中检测FCoV毒株。在琼脂糖凝胶电泳中发现很少的非特异性条带。通过测序分析证实了针对所有PCR产物的靶序列的特异性扩增。
对该区域的测序分析允许区分I型和II型血清型。FCoV、CCoV、TGEV和PRCV株之间nsp14部分序列的核苷酸同一性范围为89.9%至%。通过基于nsp14部分核苷酸序列(bp)的系统发育分析，我们能够成功区分I型-FCoV基因型与II型-FCoV、CCoV或TGEV，我们的方法没有区分II型FCoV和CCoV基因型。
在本研究中，我们使用针对nsp14的PCR和直接测序方法，调查了来自临床患病猫的FCoV毒株，这些猫疑似患有FIP，医院中没有通过完整的临床病理学或病理学检查进行确认。在腹膜和胸膜液样本中，FCoV分别在个样本中的55个(53.4%)和45个样本中的14个(31.1%)中被检测到。所有这些都表现出I型FCoV基因型。在比较腹腔和胸腔积液样本的FCoV阳性率时，我们发现两者之间存在统计学显著差异。
另一方面，来自只临床患病猫的份血样、9份脑脊液样品和1份心包积液样品的nsp14PCR阳性结果分别为19份(8.9%)、0份(0%)和1份(%)。只有一份血样显示II型-FCoV或CCoV基因型。
使用nsp14氨基酸序列分型(nsp14aaST)，这是一种基于nsp14的个氨基酸残基的等位基因分析，我们在本研究的89个FCoV阳性样品中鉴定了53个独特的ST。
日本家猫中最主要的基因型是ST42(89个中的24个，27.0%)，它在全基因组测序的菌株中也最常见，其次是ST8(n=10)和ST25(n=7)，前三个STs占FCoV阳性样品总数的46.1%。在本研究的腹水标本中，ST42是最常见的基因型(n=18)，其次是ST8(n=5)和ST25(n=5)。在胸腔积液和血液样品中，分别鉴定出多个菌株ST42(n=4)、ST8(n=2)和ST8(n=3)、ST25(n=2)、ST42(n=2)。
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讨论
在以前的流行病学研究中，靶向3′-UTR和刺突序列的巢式PCR技术已被广泛用于病毒检测和分别区分I型和II型血清型，然而，以前的方法很费时，并且在巢式PCR过程中经常发生非特异性扩增。我们的nsp14PCR方法允许使用单一PCR检测FCoV，在各种临床标本的PCR过程中几乎没有非特异性扩增发生，这表明引物组仅对病毒基因组表现出高特异性。因此，我们的方法允许准确地确定FCoV在任何类型的标本中的存在，而无需通过PCR产物的测序来确认。最近，Soma等报道了使用3′-UTR巢式PCR方法在日本疑似湿FIP的猫的腹水中FCoV的阳性率为44.1%(只中的只)。
使用nsp14aaST的方案，我们发现FCoV的克隆ST42在日本家猫中流行。ST42FCoV克隆很可能也是世界范围的地方病，因为它占了在NCBI登记的大部分全基因组测序的毒株。ST8和ST25FCoV克隆的全球分布仍有待阐明，它们是仅次于日本ST42的第二和第三最常见的STs。因此需要进一步的流行病学研究。
腹水来源的FCoV毒株中特异性STs的聚集分布与血液标本中的分布形成对照，后者形成了几乎随机的模式，这表明在FCoV群体中存在嗜性腹水克隆。有趣的是，胸腔积液中FCoV毒株的多样性和均匀性与血液中的相似。
编辑：曹海旭
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