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背景介绍：恶性肿瘤在播散、侵袭、转移的过程中常伴有肿瘤细胞进入体液，如血液、胸腹水、脑脊液等。恶性胸腔积液（MPE）往往是许多癌症的第一个迹象，与多种恶性肿瘤有关，如非小细胞肺癌（NSCLC），乳腺癌，卡波济氏肉瘤，淋巴瘤等，常发生在转移性恶性肿瘤患者中。因此，在这些体液样本中找到肿瘤细胞是判定肿瘤存在，甚至转移的有效证据。但是这些体液样本中包含多种细胞且肿瘤细胞数目常常较少，给临床检测带来挑战。
传统的MPE诊断方法：
1、细胞学检查：有局限性，特别是当肿瘤细胞较少时，可能会被胸腔积液中的间皮细胞混淆；
2、胸腔穿刺术：一种传统的微创诊断工具，只有60%的低敏感性；
3、免疫组织化学提高了诊断MPE的灵敏度，但没有通用的恶性肿瘤标记物，且染色标记耗时较长；
因此，这些方法可能不会直接适应于恶性积液的明确诊断，因为它们不能区分胸腔积液中恶性肿瘤细胞、良性上皮细胞等细胞类型。
解读专栏：01研究思路
葡萄糖摄取增加是癌细胞的一个标志，已被应用于正电子发射断层扫描PET，以检测体内的恶性肿瘤。推测，在胸腔积液或外周血中，葡萄糖摄取增加且没有白细胞标记物表达的细胞很可能是可以通过单细胞测序证实的恶性细胞。利用肺癌患者恶性肿瘤细胞与良性细胞葡萄糖摄取的差异，将所有细胞通过一个包含20万微孔的芯片进行初筛，利用荧光标记的葡萄糖类似物2-NBDG并结合白细胞标记物CD45染色标记，能够发现代谢值特别高的疑似肿瘤细胞，相当于给每个细胞都做了一次PET-CT。为了进一步验证，再将这些疑似肿瘤细胞一一取出进行单细胞测序验证。
02研究过程
1、检测平台的工作原理和验证
工作原理：用氯化铵裂解缓冲液除去红细胞RBCs，然后所有有核细胞悬浮于HBSS平衡盐溶液中并用anti-CD45，2-NBDG和ethd-1（死细胞标记物）标记，置于微孔芯片中检测。CD45/2-NBDG/ethd-1三重标记后，检测系统识别这三种荧光信号，ethd-1-、CD45-，及表现出高的葡萄糖的摄取（2-NBDGhigh）是疑似肿瘤细胞，确定后的疑似肿瘤细胞被自动检索，然后进行单细胞测序确认细胞恶性程度。（注：2-NBDG是荧光标记的D-葡萄糖类似物，遵循细胞内类似的代谢途径。与非恶性细胞相比，2-NBDG迅速被恶性细胞摄取，并提供光学标记来检测恶性细胞。）
设想验证：微孔芯片中的细胞A（NSCLC细胞系）与取自三例健康献血者的血液样本中的有核细胞（抗CD45-标记），缺糖处理10分钟，然后于0.4mM2-NBDG和4μMethd-1，37℃20min孵育，检测所有的细胞的2-NBDG，CD45，ethd-1的荧光信号。如图1D所示，对2-NBDG吸收直方图，可以明确区分白细胞和代谢活跃的肿瘤细胞。在单细胞PET检测中也观察到了类似的清晰分离，其中使用放射性葡萄糖类似物FDG，测定肿瘤细胞和白细胞的葡萄糖摄取。因此，2-NBDG与FDG在体外细胞摄取葡萄糖定量一致。
确认2-NBDG作为检测代谢活跃的肿瘤细胞的标记物。
2、鉴定肺癌患者胸腔积液样品中代谢活性肿瘤细胞
用一组NSCLC的胸腔积液样本测试这个检测平台的效用。
从每位病人胸腔积液样本中采集到约个有核细胞（别藻蓝蛋白（APC）标记的抗CD45抗体标记）置于微孔芯片筛选疑似肿瘤细胞。采用了A细胞（荧光强度～）的2-NBDG摄取平均值作为代谢活跃细胞的临界值。如下图所示，在所有的患者PE样本中测试，没有白细胞对2-NBDG的摄取是高于这个临界值。
图2A.显示患者1胸腔积液样品中的疑似肿瘤细胞，CD45阴性且表现出2-NBDGhigh。在这个患者1的1毫升胸腔积液样本中总共有五个代谢活跃的疑似肿瘤细胞被确认，基于ethd-1?/CD45?/2-NBDG准则，然后依次进行单细胞测序，检测致癌基因（EGFR，KRAS，PIK3CA，BRAF，TP53），发现五个疑似肿瘤细胞中的三个在KRAS基因2号外显子第12位密码子错义突变（g12c），从甘氨酸突变成半胱氨酸（GGTTGT），所检测到的突变与患者原发病灶中发现的突变状态一致。这三个携带KRAS突变的细胞因此被确认为肿瘤细胞，证实患者1的胸腔积液有恶性介入，同时患者1的MPE被传统细胞学检查证实。
对这五个假定细胞进行了WES测序。定制肺癌panel筛选这些突变，其中包含45个与肺癌最相关的致癌基因和抑癌基因。野生型KRAS的细胞3和4，携带错义突变的基因包括BRAF，PIK3CA、PTEN、EGFR、TP53，和其他三个KRAS突变的肿瘤细胞聚类热图相似（图2D），表明这两个细胞恶性几率较高。
3、高葡萄糖摄入的肺癌细胞中CK的异质性表达
在患者2（原发病灶EGFR，lr突变）胸腔积液样本中有6个细胞被确定为疑似肿瘤细胞（图3A）。测序结果显示4个细胞具有一致EGFRlr突变（CTGCGG），且其中有一个细胞同时发生EGFRlr突变和PIK3CAEk突变（GAAAAA）。突变扩增阻滞系统（ARM）分析检测到EGFRT90M突变发生在6个细胞中的其中2个细胞里。
EGFRT90M和PIK3CAEk突变已被发现与EGFRTKI耐药相关。测序结果与患者先前接受EGFRTKI治疗然后在胸腔积液扫描时发展耐药的事实一致。
在患者2的另一份胸腔积液样本中，这些肿瘤细胞只有～约40%被发现是CK阳性的，指示完全基于CK+/CD45?/DAPI+定义的肿瘤细胞检测是不完全的。
MPE的诊断性能优于传统的细胞学诊断
4、拓展至肺癌患者外周血中游离癌细胞的检测
这种在胸腔积液检测使用的、基于代谢的简单检测方法也可以拓展至肺癌患者外周血中少量游离癌细胞的检测。
03研究小结
1、实验结果表明，对于肺癌患者的胸腔积液样本，超过60%的疑似肿瘤细胞均反应了原位肿瘤细胞的细胞特征；
2、在部分传统细胞学检查为阴性或无法确诊的样本中，该方法能够有效在胸腔积液中找到含量少且游离的肿瘤细胞并通过测序加以确认；
3、该方法还可应用于外周血样本中检测少量游离癌细胞。
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稿件来源：技术中心孙娜娜
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